Editéiert vum Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Kalifornien, guttgeheescht de 25. Dezember 2020 (iwwerpréift de 25. Oktober 2020)
Mir berichten d'Interaktioun tëscht Ënnerunitéiten an der Replikatioun vu Coronavirussen-Transkriptiounskomplexen, déi wesentlech fir Replikatioun an evolutiver Konservatioun sinn.Mir hunn Beweiser geliwwert datt den NiRAN Domain verbonne mat nsp12 Nukleosid Monophosphat (NMP) Transferase Aktivitéit am Trans huet, an nsp9 (en RNA bindend Protein) als Zil identifizéiert.NiRAN katalyséiert d'kovalent Uschloss vun der NMP-Moiet un de konservéierten nsp9 Aminoterminus an enger Reaktioun déi op Mn2+ Ionen an ugrenzend konservéiert Asn Reschter hänkt.Et gouf fonnt datt NiRAN Aktivitéit an nsp9 NMPylatioun wesentlech fir Coronavirus Replikatioun sinn.D'Daten erlaaben eis dës Aktivitéit vum nestéierte Virusenzymmarker mat de fréiere Beobachtungen an der Hypothese ze verbannen, datt d'Initiatioun vun der RNA-Synthese an enger Klass vun RNA-Viren funktionell an evolutiv konsequent ass.
D'RNA-ofhängeg RNA-Polymerase (RdRps) vun Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, an 12 aner Famillen) ass verbonne mat dem Amino-terminalen (N-terminalen) Domain am net-strukturelle Protein (nsp), deen aus dem Polyprotein verëffentlecht gëtt, genannt NiRAN 1ab besteet aus viraler Haaptprotease (Mpro).Virdrun, der arterial Virus NiRAN-RdRp nsp senger eegener GMPylation /UMPylation Aktivitéit gemellt gouf, an et war virgeschloen eng transient fir den Transfert vun nucleoside monophosphate (NMP) zu der (aktuell onbekannt) Virus an /oder Zell biopolymerization Saachen ze generéieren.Hei weisen mir datt de Coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E a Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-ofhängeg NMPylatiounsaktivitéit huet, déi aus nsp9 ofgeleet gëtt duerch d'Bildung vu Mpro-mediéierten nsp9 No d'N-terminal flankéiert nsps gëtt proteolytesch fräigelooss, de Phosphoramidat ass un de primäre Amin (N3825) um N-Terminal vun nsp9 gebonnen.Uridin Triphosphat ass de bevorzugten Nukleotid an dëser Reaktioun, awer Adenosin Triphosphat, Guanosin Triphosphat, a Cytidin Triphosphat sinn och gëeegent Co-Substrater.Mutatiounsstudien mat rekombinanten Coronavirus nsp9 an nsp12 Proteinen a genetesch manipuléierte HCoV-229E Mutanten hunn d'Reschter bestëmmt fir NiRAN-mediéiert nsp9 NMPylatioun a Virusreplikatioun an der Zellkultur.D'Donnéeën bestätegt d'Prognose vun NiRAN aktiv Site Reschter a bestëmmt déi wichteg Roll vun nsp9 N3826 Reschter an nsp9 NMPylation a Virus Replikatioun in vitro.Dëse Rescht ass Deel vun der konservéierter N-terminaler NNE Tripeptid Sequenz a bewisen als deen eenzegen invariante Rescht vun nsp9 a sengen Homologen an der Coronavirus Famill.Dës Etude stellt e zolitte Fundament fir déi funktionell Studie vun der NMPylatiounsaktivitéit vun anere nested Viren a proposéiert méiglech Ziler fir d'Entwécklung vun antiviralen Drogen.
Nidovirales positiv-stranded RNA Virus infizéiert eng Vielfalt vu Wirbelen an Invertebraten (1, 2).D'Uerdnung enthält de Moment 14 Famillen (3), vun deenen d'Coronavirus Famill an de leschten 20 Joer extensiv studéiert gouf.Zu där Zäit sinn dräi zoonotesch Coronavirussen aus Déierehoster entstanen an hunn grouss Ausbrieche vu schwéieren Atmungsinfektiounen bei Mënschen verursaacht.Inklusiv persistent Pandemie verursaacht duerch schwéier akuter infektiiv Krankheeten.Atmungssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââââ7).Nidovirusen deelen eng gemeinsam Genom Organisatioun, an d'Ënnerunitéit vum Membran-gebonnenen Replikatioun-Transkriptiounskomplex (RTC) ass an de 5-?²-Terminal Zwee-Drëttel an der Haaptstrukturell Ënnerunitéit vum Viruspartikel kodéiert, souwéi e puer Accessoiren .Protein, kodéiert am 3??² Enn Drëttel vum Genom (1).Ausser fir eng Famill vun planarian Viren (Monoviridae) (8), codéieren all nested Viren RTC Ënnerunitéiten an zwee grouss oppe liesen Rummen (ORF) ORF1a an ORF1b, déi aus genomic RNA vun iwwersat ginn.ORF1a codéiert Polyprotein (pp) 1a, an ORF1a an ORF1b codéieren gemeinsam pp1ab.Mat der allgemenger Participatioun vun der Haaptprotease (Mpro) kodéiert vun ORF1a, ginn souwuel pp1a wéi och pp1ab proteolytesch an eng Vielfalt vun net-strukturelle Proteinen (nsps) veraarbecht, och bekannt als 3CLpro, well et Homologie mat der 3Cpro vum Picornavirus huet ( 9).Dës nsps ginn ugeholl datt se an eng grouss dynamesch RTC versammelt ginn, d'Synthese vu genomesche RNA (Replikatioun) katalyséieren an e Set vun subgenomesche RNA (Transkriptioun), a gi benotzt fir den Ausdrock vum ORF ze koordinéieren, deen erof vum ORF1b läit (10? ? ?12).
De Kär RTC enthält RNA-ofhängeg RNA Polymerase (RdRp) (13), Superfamily 1 Helicase (HEL1) (14, 15) a verschidde RNA Veraarbechtungsenzyme, déi haaptsächlech an ORF1b an der Coronavirus Famill kodéiert sinn. Et enthält nsp12-nsp16 an nsp9-nsp12 an der Arterioviridae Famill (kuckt Referenz 10ââ 12).RdRp an HEL1 representéieren zwee (e Fënneftel) konservéiert Domainen vum Vugelnestvirus an hunn Homologie ënner anerem RNA Viren.Core Replicase gëtt ugeholl datt se vun aneren Ënnerunitéiten assistéiert ginn, dorënner e puer kleng nsps, déi aus der Carboxy-Terminal (C-Terminal) Regioun vu pp1a, downstream vum Mpro (coronavirus nsp5 an arteriell Virus nsp4) verëffentlecht ginn.Si hu limitéiert Familljespezifesch Schutz a verschidden Aktivitéiten (iwwerpréift an Referenz 10ââ12).
Relativ kierzlech gouf en Domain mat eenzegaartege Sequenzmotiv Charakteristiken um Aminoterminus (N-Terminus) nieft RdRp an all nested Viren fonnt, awer keng aner RNA Viren (16).Baséierend op senger Positioun an der Nukleotidtransferase (Nukleosid Monophosphat [NMP] Transferase) Aktivitéit, gëtt dësen Domain NiRAN (Nestvirus RdRp-verbonne Nukleotidtransferase) genannt.D'Dual-Domain Kombinatioun vun NiRAN-RdRp besteet aus nsp12 an der Coronaviridae Famill an nsp9 an der Arterioviridae Famill, an an aneren nestoviridae, NiRAN-RdRp gëtt erwaart als onofhängeg nsp vum virale Polyprotein verëffentlecht ze ginn.Am Coronavirus enthält den NiRAN Domain ??1/450 Reschter a gëtt mam C-terminal RdRp Domain duerch d'Linkerregioun (16?19) verbonnen.Am Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), rekombinant nsp9 weist Mn2+ Ion-ofhängeg (selbst) UMPylatiouns- a GMPylatiounsaktivitéiten, déi ofhängeg vun dräi konservéierte Sequenzbasen am Nestovirus, AN, BN a CN D'Reschter an der Sequenz.Wou N fir NiRAN steet) (16).D'N-terminal Flankéierung vun dëse Motiver ass e manner konservativt Motiv preAN.E puer vun dëse Reschter sinn och a wäit verwandte Proteinkinasen konservéiert, wou se bewisen gi sinn an der Nukleosidtriphosphat (NTP) Bindung a katalytescher Aktivitéit involvéiert ze sinn (20, 21).Konsequent mat dëser Observatioun kënne verschidde Schlësselaktiv Sitereschter an der Pseudokinase SelO vu Pseudomonas syringae mat dem kierzlech publizéierten SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 Superkomplex zesummegesat ginn.Konservéiert Coronavirus NiRAN Reschter iwwerlagert an der Elektronenmikrostruktur.Rekombinant Protein (17).Et gëtt spekuléiert datt déi dokumentéiert (selbst) U / GMPylatioun e transienten Zoustand wäert produzéieren fir NMP op den (aktuell onbekannte) Substrat (16) ze transferéieren, an déi strukturell Ähnlechkeet tëscht NiRAN a Proteinkinase (17, 19) ass d'Hypothese datt NiRAN ännert aner Proteinen.
Vill Fonctiounen, dorënner seng eenzegaarteg an eenzegaarteg systematesch Associatioun mat nested Viren an genetesch Trennung vun RdRp, maachen NiRAN engem raisonnabel Schlëssel reglementaresche Enzym fir nested Viren, déi kritesch ass fir hir Entstoe an Identitéit.Virdru goufen dräi méiglech Funktiounen mat NiRAN involvéiert fir Genom / subgenomesch Iwwersetzung oder Replikatioun / Transkriptioun ze regelen.Wann Dir déi knapp an onkomplett Donnéeën déi zu där Zäit verfügbar ass, berécksiichtegt, huet all Funktioun seng Virdeeler an Nodeeler (16).An dëser Fuerschung ziele mir déi biochemesch a ëmgedréint genetesch Studien vun de Coronavirussen ze kombinéieren déi zwee Gattungen representéieren, an eis Erkenntnisser an den evolutiven Hannergrond vun der natierlecher Mutatioun vun der Coronavirus Famill ze setzen, fir Abléck an dëst Mysteriéis Räich ze kréien.Mir mellen grouss Fortschrëtter am Versteesdemech vun NiRAN duerch d'Identifikatioun vun natierlechen Ziler am RTC, déi (ënner den dräi verfügbaren Hypothesen) zu der Roll vun dësem Domain bäidréit fir d'Synthese vun nested Virus RNA ze initiéieren.Dës Fuerschung mécht och Méiglechkeeten op fir aner Rollen vum NiRAN op der Virushost-Interface.
Fir d'enzymatesch Eegeschafte vum Corona Virus nsp12-verbonne NiRAN Domain ze charakteriséieren, hu mir eng rekombinant Form vum mënschleche Coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 an E. coli produzéiert, mat engem His6 Tag um C-Terminus, a kombinéiert de Protein mat [α32-P] Inkubéiert zesumme mat NTP an der Präsenz vu MnCl2 wéi an Materialien a Methoden beschriwwen.D'Analyse vum Reaktiounsprodukt huet d'Präsenz vun engem radiolabeléierte Protein ugewisen, dee mam nsp12 (106 kDa) migréiert, wat beweist datt de Coronavirus nsp12 d'Bildung vu kovalente Protein-NMP-Addukten katalyséiert, préférentiell geformt mat Uridinmonophosphat (UMP) (Figur 1A) An B).Quantitativ Analyse huet gewisen datt am Verglach mat aneren Nukleotiden d'Signalintensitéit vun der UMP-Inkorporatioun ëm 2 bis 3 Mol eropgaang ass (Dorënner 1C).Dës Donnéeë sinn konsequent mat der virausgesoter NMP Transferase Aktivitéit vum NiRAN Domain vum Coronavirus (16), awer beweist datt d'Nukleotidvirléiften vum NiRAN Domain vum Coronavirus an dem arterielle Virus anescht sinn.
Selbst-NMPylatiounsaktivitéit vum HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) gouf mat der designéierter [α-32P] NTP an der Präsenz vu 6 mM MnCl2 fir 30 Minutten inkubéiert (kuckt Materialien a Methoden fir Detailer).D'Reaktiounsprodukter goufen duerch SDS-PAGE getrennt a mat Coomassie brillant blo gefierft.(B) De radiolabeléierte Protein gëtt duerch Phosphorbildung visualiséiert.D'Positioune vun nsp12-His6 a Protein Molekulare Mass Markéierer (an kilodaltons) sinn an A an B. (C) D'Intensitéit vun der radioaktiv Signal (Moyenne ± SEM) war vun dräi onofhängeg Experimenter bestëmmt.*P≤0,05.D'Signalstäerkt (Prozentsaz) ass mat UTP verbonnen.
Och wann NiRAN-relatéiert Enzymaktivitéite essentiell fir d'Replikatioun vun EAV a SARS-CoV an der Zellkultur gewisen goufen (16), sinn déi spezifesch NiRAN Funktioun a potenziell Ziler nach net festgeluegt.Déi kierzlech gemellt strukturell Ähnlechkeet tëscht NiRAN an enger Famill vu Proteinen mat Proteinkinase-ähnleche Falten (17, 22) huet eis opgefuerdert d'Hypothese ze testen datt NiRAN d'NMPylatioun vun anere Proteinen katalyséiert.Mir hunn eng Rei vu potenziellen homologen Ziler generéiert, dorënner net-strukturell Proteine kodéiert vun HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), all mat engem C-terminal His6 Tag (SI Appendix, Table S1), An inkubéiert dës Proteinen mat [α32-P] Uridintriphosphat ([α32-P]UTP) an der Präsenz oder der Verontreiung vu nsp12.Bovine serum albumin an MBP-LacZα Fusioun Protein produzéiert an E. coli zerwéiert als Kontrollen (Dorënner 2A, Bunnen 1 bis 7).D'radiolabeled Protein war vun Natrium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelies electrophoresis (SDS-PAGE) an autoradiography analyséiert, an et gouf fonnt, datt et e staarkt radioaktiv Signal an der Reaktioun nsp12 an nsp9 enthält.D'Positioun vum Signal entsprécht der molekulare Mass vun nsp9, besot nsp12-mediated UMPylation vun nsp9 (Dorënner 2B, Streck 7).Keng aner Testproteine goufen UMPyléiert fonnt, wat eis gefouert huet fir ze schléissen datt nsp9 e spezifesche Substrat vun nsp12 ass.Konsequent mat de Selbst-NMPylatiounsdaten an der Figur 1 gewisen, ass nsp12 fäeg all véier NMPs op nsp9 ze transferéieren, obwuel d'Effizienz anescht ass, UMP> Adenosin Monophosphat (AMP)> Guanosin Monophosphat (GMP)> Cytidin Monophosphat (CMP)) ( Bild).3 A und B).Ënnert de Konditiounen, déi an dësem Assay benotzt ginn (verkierzt d'Reaktioun an d'Beliichtungszäit, reduzéieren d'Konzentratioun vun nsp12; Materialien a Methoden), konnt d'Selbst-NMPylatioun vun nsp12 net erkannt ginn (vergläicht Figur 2B, Spur 7, an Figur 1B), déi bewisen eng effektiv (A multiple Ronnen) UMP geplënnert aus nsp12 zu nsp9.UMP transferase Aktivitéit verlaangt d'Präsenz vun Mn2 + Ionen, wéi an Dorënner 3C gewisen, iwwerdeems nëmmen minimal UMP transferase Aktivitéit an der Präsenz vun Mg2 + observéiert gouf, a keng Aktivitéit an der Präsenz vun den aneren zwee divalent Kationen getest.Ähnlech Donnéeën goufen an NMPylation assays kritt mat cytidine triphosphate (CTP), guanosin triphosphate (GTP), an adenosine triphosphate (ATP) (SI Unhang, Dorënner S1).
HCoV-229E nsp12-mediéiert UMPylatioun vun nsp9.Eng Serie vu Proteinsubstrater (inklusiv Rëndfleesch Serum Albumin, MBP-lacZα, an eng Serie vun HCoV-229E nsps markéiert mat C-terminal His6 kodéiert vun ORF1a) goufen benotzt fir d'UMPylatiounsaktivitéit vun HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediéierten ze evaluéieren. protein.Inkubéiert de Protein mat [α-32P] UTP fir 10 Minutten an der Verontreiung (A) oder Präsenz (B) vun nsp12 wéi an de Materialien a Methoden beschriwwen.Am Top vun A a B gëtt SDS-Polyacrylamidgel gefierft mat Coomassie Brilliant Blue gewisen, an um Enn vun A a B ginn déi entspriechend Autoradiogramme gewisen.D'Positioun vum Proteinmolekulare Massemarker (a Kilodalton) gëtt op der lénker Säit uginn.D'Positioun vun nsp12-His6 (B, Spëtzt) an de radioaktive Signal observéiert während der Inkubatioun vun nsp12-His6 mat nsp9-His6 (B, Spuer 7) ginn och uginn, wat beweist datt [α-32P]UMP zu nsp9-His6 (12,9 kDa), wat net fir aner getest Proteinen observéiert gouf.
HCoV-229E NiRAN-mediéiert biochemesch a virologesch Charakteriséierung vun nsp9 NMPylatioun.(A a B) D'Roll vum Nukleotid-Co-Substrat, deen an der Reaktioun benotzt gëtt.Nsp12-His6 an nsp9-His6 gi gemëscht an inkubéiert an der Präsenz vu verschiddene [α-32P] NTPs am Standard NMPylatiounsassay.(A, uewen) Coomassie-gefierft nsp9-His6 getrennt duerch SDS-PAGE.(A, ënnen) Autoradiograph vum selwechte Gebitt vum Gel.(B) Déi relativ Aktivitéit (Mëttel ± SEM) an der Präsenz vum designéierte Nukleotidkofaktor gëtt aus dräi onofhängegen Experimenter bestëmmt.*P≤0,05.(C) D'Roll vun Metallionen.Gewise gëtt de Standard NMPylatiounstest a Präsenz vun [α-32P] UTP a verschiddene Metallionen, jidderee mat enger Konzentratioun vun 1 mM.Am C, uewen, Coomassie gefierft nsp9-His6 gëtt gewisen, an am C, ënnen, gëtt déi entspriechend Autoradiographie gewisen.D'Gréisst vum markéierte Protein (a Kilodaltonen) gëtt lénks vun A a C gewisen. (D) D'mutant Form vun HCoV-229E nsp12-His6, déi déi spezifizéiert Aminosaier Substitutioun droen ass an [α-32P]UTP, wéi beschriwwen. an Material a Methoden.De radiolabeléierte nsp9-His6, deen an der NMPylatiounsreaktioun produzéiert gëtt, gëtt duerch Phosphorylatiounsbildung (D, uewen) festgestallt.Déi relativ Aktivitéit am Verglach mam Wild-Typ (wt) Protein gëtt an D gewisen, an den ënneschten ass als Duerchschnëtt (± SEM) vun dräi Onofhängeg Experimenter geholl.Asterisken weisen Auswiesselungen vun net-konservéierte Reschter.(E) De Virus Titer an der Kultur Supernatant vun p1 Zellen kritt 24 Stonnen no der Infektioun gouf duerch Plaque Assay bestëmmt.D'Codon Auswiesselungen am NiRAN Domain vum manipuléierten HCoV-229E Mutant ginn uginn (Reschtnummeréierung baséiert op hirer Positioun am pp1ab).D'Replikatioun-defizit RdRp aktiv Site mutant nsp12_DD4823 /4AA war als Kontroll benotzt.
Fir e méi déif Verständnis vum aktive Site vun NiRAN ze kréien an d'Reschtreschter am Zesummenhang mat der Aktivitéit vun nsp9-spezifeschen NMP Transferase ze bestëmmen, hu mir Mutatiounsanalyse gemaach, an där mir déi konservativ Reschter an den NiRAN AN, BN an CN Motiver ersat hunn ( 16) Et ass Ala (SI Anhang, Figur S2).Zousätzlech, war den Impakt vun konservativen Arg-zu-Lys oder Lys-zu-Arg Auswiesselungen an zwee Fäll évaluéieren.Als (negativ) Kontroll ginn d'Reschter déi net oder manner am NiRAN-Domain vu Coronavirussen an aner nestéiert Viren konservéiert sinn duerch Ala ersat.Ersetzen K4116A (am Motiv preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (Motiv) BN) an D4280A (CN) reduzéiert oder souguer eliminéiert nsp9 NMPylatioun duerch nsp12, wärend Proteine mat konservativen Ersatzstécker (R4178K), K4116R) 60% an 80% vun hirer Aktivitéit behalen, wat beweist datt d'Entspanung vun de Restriktiounen op hir jeeweileg Säit Ketten ass physeschchemesch sensibel (Figur 3D).Verschidde aner konservéiert Reschter E4145A, D4273A, F4281A an D4283A ersetzen ass vill manner schiedlech, an nsp9 UMPylatioun ass nëmme mëttelméisseg reduzéiert.Ähnlech Resultater goufen an nsp9 NMPylatiounsreaktiounen kritt, déi aner NTPs involvéiert (Dorënner 3D a SI Appendix, Figur S3), bestätegen datt déi observéiert Effekter op spezifesch Aminosäuresubstitutiounen onofhängeg sinn vun der Aart vum Nukleotid Co-Substrat benotzt.Als nächst hu mir de méiglechen Impakt vun dësen nsp12 Auswiesselungen op d'Replikatioun vu Coronavirussen an der Zellkultur getest.Zu dësem Zweck hu mir entspriechend genetesch manipuléiert komplementär DNA (cDNA) Schabloune benotzt, déi am rekombinanten Vacciniavirus (23, 24) gekloont sinn, fir 5 -7 Zellen ze transkriberen.Titratioun vun ustiechend Virus Nokomme produzéiert an dësen Zellen gewisen, datt déi meescht HCoV-229E NiRAN Mutanten net machbar waren (Dorënner 3E).Eng Grupp vun net-liewensfäeg virale Mutanten enthält Alternativen déi gewise goufen fir NMP Transferase Aktivitéit in vitro ze eliminéieren oder wesentlech ze reduzéieren (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), awer et ginn zwou aner Alternativen (K4116R, E4145A) % reservéiert?Hir in vitro NMPylatiounsaktivitéit hindeit datt zousätzlech Restriktiounen involvéiert sinn.Ähnlech zwee aner Mutatiounen (R4178K, F4281A), déi eng moderéiert Ofsenkung vun der NiRAN's in vitro NMPylatiounsaktivitéit verursaacht hunn, hunn Live Viren produzéiert, awer dës Viren hunn d'Titer duerch Replikatioun wesentlech reduzéiert.Konsequent mat den in vitro Aktivitéitsdaten, déi an der Figur 3D gewisen ginn, ersat véier aner Reschter déi net am Coronavirus an/oder aner nestéiert Virussen (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) liewensfäeg Viren produzéiert hunn. e mëttelméisseg reduzéierten Titer am Verglach zum Wild-Typ Virus (Dorënner 3E).
Fir ze studéieren ob NiRAN-mediéiert NMP-Transferase-Aktivitéit vum aktive RdRp-Domän hänkt, sinn déi zwee konservéiert Asp-Reschter, déi an der Koordinatioun vun divalente Metallionen (11) am RdRp-Motiv C involvéiert sinn, duerch Ala ersat. seng nsp9 NMPylatiounsaktivitéit, wat beweist datt nsp12-mediéiert in vitro nsp9 NMPylatiounsaktivitéit keng Polymeraseaktivitéit erfuerdert (SI Anhang, Figur S4).
Nodeem d'nsp9-spezifesch NMP Transferase Aktivitéit fir nsp12 gegrënnt gouf, hu mir probéiert den NMP-nsp9 Addukt duerch Massespektrometrie (MS) ze charakteriséieren.De komplette Protein Massespektrum vum rekombinante HCoV-229E nsp9 huet e Peak bei 12.045 Da gewisen (Dorënner 4A).D'Zousatz vun nsp12 huet d'Qualitéit vun nsp9 net geännert, wat beweist datt nsp12 an nsp9 net e stabile Komplex ënner de benotzte Bedéngungen bilden (Denaturatioun) (Dorënner 4A).A Präsenz vun UTP a GTP huet d'Massmiessung vun der Reaktioun mat nsp9 respektiv nsp12 gewisen datt d'Proteinmass vun UTP sech 306 Da bewegt, an d'Proteinmasse vum GTP bewegt 345 Da, wat beweist datt all nsp9 Molekül en UMP oder GMP bindt. (Bild 4) C an D).Et gëtt spekuléiert datt d'Energie erfuerderlech fir NiRAN-mediéiert nsp9 NMPylatioun aus NTP Hydrolyse a Pyrophosphat Verëffentlechung kënnt.Och wann en 10-fache molar Iwwerschoss vun nsp9 (Ziel) wéi nsp12 (Enzym) an dëser Reaktioun benotzt gouf, gouf bal komplett NMPylatioun vun nsp9 observéiert, wat beweist datt d'Interaktioun tëscht nsp12 an nsp9 kuerzlieweg ass, an nsp12 kann NMPyléiere méi nsp9 in vitro Molekül.
Single NMPylatioun vun nsp9 a Präsenz vun nsp12 an UTP oder GTP.Gewise gëtt de deconvolutéierte komplette Proteinmassspektrum vum HCoV-229E nsp9 (SI Appendix, Table S1) (AD).(A) nsp9 eleng, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 an der Präsenz vun UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 an der Präsenz vu GTP.
Fir d'nsp9 Reschter UMPylated vun nsp12 ze bestëmmen, war nsp9-UMP mat trypsin gekleet.Déi resultéierend Peptiden goufen duerch Nano-High Performance Liquid Chromatography (HPLC) getrennt an duerch Tandem Massespektrometrie (MS / MS) online analyséiert.Datenanalyse mat dem Byonic Software Package (Protein Metrics) huet d'UMPylatioun vun der N-terminal Aminosaier gewisen.Dëst gëtt manuell bestätegt.D'Tandem Mass Spektrum vun der Virleefer peptide [UMP] NNEIMPGK (SI Unhang, Dorënner S5A) réischt e Fragment op 421 m /z, beweist, datt UMP bis Rescht 1 vun nsp9 bindet.
Am N-Terminus vun nsp9 ass Asn ënner de Membere vun Orthocoronavirinae (SI Appendix, Figur S6) konservéiert.Och wa mir gleewen datt den N-terminal primäre Aminstickstoff dee wahrscheinlechste Akzeptor fir UMP ass, hu mir beschloss zousätzlech Beweiser fir NMP-Bindung um N-Terminal ze kréien.Aus dësem Grond gouf den net-NMPyléierten an NMPyléierten N-terminale Peptid nsp9 gereinegt duerch HPLC ofgeleet an der Präsenz vun Aceton a Natriumcyanoborhydrid.Ënner dëse Bedéngungen kënnen nëmme fräi primär Amine mat Propyl (25) geännert ginn.D'N-terminal nsp9-ofgeleet Peptid mat der Sequenz NNEIMPGK enthält zwee primär Aminen, een am N-Terminus vun Asn an deen aneren an der Säitkette vu Lys am C-Terminus.Dofir kënne Propylgruppen op béide Säiten agefouert ginn.Déi extrahéiert Ionchromatogramme vun net-NMPyléierte Peptiden ginn am SI-Anhang, Figur S5B, gewisen.Wéi erwaart, N-terminal an C-terminal (mono) propylated (SI Unhang, Figur S5B, ieweschte Lane) an dipropylated peptides (SI Unhang, Figur S5B, ënneschten Lane) identifizéiert ginn.Dëst Muster ännert sech mat der Notzung vum NMPyléierten N-terminale Peptid vun nsp9.An dësem Fall kënnen nëmmen C-terminal propyléiert Peptiden identifizéiert ginn, awer N-terminal propyléiert Peptiden an dipropyléiert Peptiden ginn net identifizéiert (SI Appendix, Figur S5C), wat beweist datt UMP op den N-terminalen primäre Amin transferéiert gouf. Grupp vun Ännerungen maachen.
Als nächst ersetzen mir (mat Ala oder Ser) oder läschen déi konservéiert Reschter um N-Terminus vun nsp9 fir Zilspezifesch Aschränkungen ze definéieren.Baséierend op eis MS Daten déi weisen datt NiRAN en nsp9-NMP Addukt mat der primärer Amin vum N-terminale Rescht vun nsp9 bildt, hu mir hypothetiséiert datt d'nsp9 NMPylatioun de virale Masterprotease (Mpro, nsp5) erfuerdert fir den nsp9 N-Terminal ze befreien. seng Polyprotein Virgänger.Fir dës Hypothese ze testen, hu mir e Virgängerprotein nsp7-11 produzéiert deen nsp9 an E. coli enthält an e Standard NMPylatiounstest an der Präsenz vun [α-32P] UTP (Materialien a Methoden) gemaach.Wéi an der Figur 5A (Spuer 3) gewisen, ass den ongeschniddene nsp7-11 Virgänger net radiolabel mat nsp12.Am Géigesaz, wann nsp7-11 duerch rekombinant nsp5 gespléckt gëtt fir nsp9 (an aner nsps) aus dem Virgänger ze befreien, gëtt e radiolabeléierte Protein festgestallt dat mam nsp9 migréiert, wat eis Conclusioun bestätegt datt NiRAN an N- Selektiv Bildung vu kovalente nsp9-NMP Addukten .Déi terminal primär Amin vum N-terminalen Asn (Positioun 3825 an pp1a / pp1ab).Dës Conclusioun gëtt och ënnerstëtzt vun Experimenter mat dem nsp9 Konstrukt, deen een oder zwee zousätzlech Reschter um N-Terminus enthält.A béide Fäll gouf NiRAN-mediated UMPylation vun nsp9 ofgeschaaft (SI Anhang, Figur S7).Als nächst hu mir e Protein produzéiert mat engem oder zwee Asn Reschter geläscht aus der 3825-NNEIMPK-3832 Peptid Sequenz um N-Terminal vun nsp9.A béide Fäll war nsp9 UMPylatioun komplett blockéiert (Dorënner 5B), déi zousätzlech Beweiser ubidden datt de richtege nsp9 N-Terminus als NMP Rezeptor handelt.
D'proteolytesch Veraarbechtung vun nsp9 an d'Roll vun N-terminalen Reschter an nsp12-mediéiert UMPylatioun.(A) nsp9 UMPylatioun erfuerdert e gratis nsp9 N-Terminal.Nsp7-11-His6 gëtt vir-inkubéiert bei 30 ° C am NMPylatiounserkennungsbuffer mat UTP an der Präsenz oder der Verontreiung vu rekombinante Mpro (nsp5-His6).No 3 Stonnen, fänkt den NMPylatiounsassay un andeems nsp12-His6 bäigefüügt gëtt wéi an Materialien a Methoden beschriwwen.D'Reaktioun mat nsp5-His6 (Spuer 1) an nsp9-His6 (Spuer 2) gouf als Kontroll benotzt.No 10 Minutten gouf d'Reaktioun ofgeschloss an d'Reaktiounsmëschung gouf duerch SDS-PAGE getrennt.D'Protein gouf mat Coomassie Brilliant Blue (A, uewen) gefierft.Den Nsp7-11-His6 Virgänger an de veraarbechte Produkt entstinn aus nsp5-His6 vermëttelt Spaltung sinn op der rietser Säit gewisen.Notéiert w.e.g. (wéinst hirer klenger Gréisst) datt nsp7 an nsp11-His6 net an dësem Gel detektéierbar sinn, an d'Reaktioun gëtt ergänzt mat nsp5-His6 (Spur 1 a 4; d'Positioun vum nsp5-His6 gëtt mat engem festen Krees ugewisen) oder nsp9-His6 (Lane 2) enthält eng kleng Quantitéit vun MBP (vun oppene Kreeser uginn) als Reschtoffall Gëftstoffer well se als MBP Fusioun Proteinen ausgedréckt ginn (SI Unhang, Table S1).(B) D'Nsp9-His6 Variant fehlt een oder zwee N-terminal Asn Reschter (Reschtnummeréierung no der Positioun an pp1a / pp1ab) a gëtt gereinegt an inkubéiert mat nsp12-His6 an [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE gefierft mat Coomassie gëtt uewen ugewisen, B, déi entspriechend Autoradiograph gëtt ënnen gewisen.D'Positioun vum Molekulargewiichtmarker (a Kilodalton) gëtt op der lénkser Säit gewisen.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal konservéiert Reschter goufen duerch Ala oder Ser ersat, an déiselwecht Quantitéit u Protein gouf an der nsp12-His6 vermëttelt UMPylatiounsreaktioun benotzt.D'Reaktiounsprodukter goufen duerch SDS-PAGE getrennt a gefierft mat Coomassie Brilliant Blue (C, Top), a radiolabeléiert nsp9-His6 gouf duerch Phosphoreszenz Imaging (C, Mëtt) festgestallt.Mat Hëllef vun Wild-Typ (wt) Protein als Referenz (op 100 gesat), gouf d'relativ NMPylatiounsaktivitéit (Moyenne ± SEM) aus dräi onofhängegen Experimenter berechent.(D) Virus Titer an der p1 Zellkultur Supernatant vun Huh-7 Zellen infizéiert mat HCoV-229E Wild-Typ Huh-7 Zellen, a Mutanten, déi designéiert Aminosaier Auswiesselungen an nsp9 droen, goufen duerch Plaque Assay bestëmmt.D'Replikatioun-defizit RdRp Motiv C duebel mutant DD4823 /4AA war als negativ Kontroll benotzt.
Den N-Terminus vun nsp9 (besonnesch Positiounen 1, 2, 3 a 6) ass ganz konservéiert ënner Membere vun der Orthocoronavirinae Ënnerfamilie (SI Appendix, Figur S6).Fir déi méiglech Roll vun dëse Reschter an nsp12-vermittelten nsp9 NMPylatioun ze studéieren, goufen zwee konsekutiv Asn Reschter um N-Terminus vun nsp9 mat Ala oder Ser (eleng oder a Kombinatioun) ersat.Am Verglach mat Wild-Typ nsp9, ersetzt N3825 mat Ala oder Ser zu méi wéi eng zweefalt Reduktioun vun der nsp12-vermittelter UMPylatioun (Dorënner 5C).Konsequent mat eiser Conclusioun datt d'NMPylatioun am N-terminalen primären Amin geschitt amplaz vun der Säitkette vum N-terminale Rescht, hu mir bedeitend Rescht NMPylatioun mam Ersatz vun N3825A an N3825S observéiert.Interessanterweis, wann den zweeten Asn duerch Ala oder Ser ersat gëtt, gëtt d'nsp9 UMPylatioun méi staark reduzéiert (méi wéi 10 Mol), während den Ersatz vun Ala op Positiounen 3, 4, a 6 nëmmen e moderéierten Effekt op nsp9 UMPylatioun huet (Figur 2). ).5C).Ähnlech Resultater goufen mat ATP kritt, CTP oder GTP (SI Unhang, Dorënner S8).Zesummen weisen dës Donnéeën d'Schlësselroll vum N2826 (Positioun 2 an nsp9) an der nsp9 NMPylatioun.
Fir zousätzlech Beweiser vun der funktioneller Korrelatioun tëscht dem N-Terminus vun nsp9 an NMPylatioun ze kréien, hu mir eng Multiple Sequenz Ausrichtung (MSA) vun der nsp9 Sequenz vun der Coronavirus Famill gemaach (variéiert tëscht 104 an 113 Reschter) (SI Appendix, Figure) S6).Am Ganzen, a 47 (bekannt a vermeintlech) Arten vu 5 Gattungen vun der Orthocoronavirinae Ënnerfamilie, déi verschidde Mamendéieren, Villercher a Reptilhären infizéieren, goufen nëmmen 8 Reschter am Ganzen invariant fonnt.Déi extensiv Ännerungen, dorënner Läschen an Insertiounen, goufen an den Zyklen tëscht de sekundäre Strukturelementer vun nsp9 observéiert, wéi duerch fréiere strukturell Studien (26 ??28) bestëmmt.Fënnef invariant Reschter goufen am β Strang an α Helix vum C-terminalen Deel vun nsp9 fonnt.Dräi invariant Reschter bilden den NNE-Motiv vum N-Terminus vun nsp9.Et gëtt opgedeckt datt den zweeten Asn vun dësem Motiv deen eenzegen invariante Rescht ass, deen och vum hypotheteschen nsp9 vum wäit verwandte Frog Coronavirus gedeelt gëtt, a representéiert d'Microhyla letovirus 1 Spezies an der Ënnerfamill Letovirinae vum Alphaletovirus.D'Konservatioun vu Reschter an nsp9 sekundäre Strukturelementer kann duerch strukturell Iwwerleeungen rationaliséiert ginn fir ausklappen oder bekannte RNA bindend Eegeschaften ze erhalen.Wéi och ëmmer, dës Begrënnung schéngt net fir d'Konservatioun vun NNE ze gëllen, a virun dëser Etude war d'Natur vun de Contrainten, déi d'Variatioun vun der Tripeptidsequenz limitéieren, komplett verstoppt.
Fir d'Wichtegkeet vun der nsp9-NMPylatioun an der NNE Konservatioun an der Coronavirus Replikatioun ze bestëmmen, hu mir HCoV-229E Mutanten produzéiert, déi eenzel oder duebel Substitutioune vun nsp9 N-terminal Reschter droen, wat beweist datt nsp9 NMPylatioun in vitro schiedlech ass.Ier mer ufänken, probéieren mir d'Fro ze beäntweren ob dës Auswiesselungen (bei der nsp8|9 Spaltplaz) d'proteolytesch Veraarbechtung vun der C-terminal pp1a Regioun beaflossen.Eng Rei vun nsp7-11 Polyprotein Konstrukter, déi entspriechend Auswiesselungen um N-Terminus vun nsp9 enthalen, goufen an E. coli produzéiert a mat rekombinanten Mpro geschnidden.D'proteolytesch Spaltung vun de véier Siten (inklusiv der nsp9 flankéierter Säit) ass net wesentlech vun all agefouerten Auswiesselungen beaflosst (SI Appendix, Figure S9), ausser strukturell Ännerungen an dëse Proteinen, déi mat Mpro-mediéierten nsp8 | 9 Spaltung (Oder aner) interferéieren. Websäit.
Huh-7 Zellen goufen mat Genom-Längt HCoV-229E RNA transfected, Kodéierung Ala oder Ser Auswiesselungen an de konservéiert NNE Tripeptiden (N3825, N3826, an E3827) um nsp9 N Termin, wat weist datt déi meescht vun de Mutatiounen fatal sinn.Mir konnten de Virus retten andeems de Ser oder Ala vum N-terminalen Asn (N2835A oder N2835S) ersat gouf, awer et ass net fäerdeg bruecht de Virus mat aneren eenzelen an duebelen Mutatiounen an der NNE Sequenz (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, ze recuperéieren, NN3825/6SS), E3827A) (Figure 5D).
Dës Resultater weisen datt d'Replikatioun vu Coronavirussen an der Tissuekultur limitéiert ass (selwecht oder ähnlech), déi natierlech Mutatioun vun nsp9 NMPylatiounsplazen am Kierper limitéiert, an d'Schlësselroll vun dëser Äntwert am Liewenszyklus vu Coronavirussen ënnerstëtzen.
Am leschte Set vun Experimenter hu mir C-terminal His6 mam Label SARS-CoV-2 nsp12 an nsp9 produzéiert, an zwou mutant Formen vun nsp12 an E. coli.Déi aktiv Site Reschter am NiRAN an RdRp Beräicher goufen respektiv Benotzt Ala amplaz (Dorënner 6A an SI Unhang, Table S2).K4465 an SARS-CoV-2 nsp12 entsprécht K4135 an HCoV-229E (SI Appendix, Figur S2), wat bewisen ass fir NiRAN Aktivitéit an HCoV-229E Replikatioun (Dorënner 3D an E) erfuerderlech ze sinn.Dëse Rescht entsprécht och dem arterielle Virus EAV nsp9 K94 Rescht, dee virdru gewise gouf fir NiRAN SelbstUMPylatioun / Selbst-GMPylatioun (16) néideg ze sinn.Wéi an der Figur 6B gewisen, huet SARS-CoV-2 nsp12 UMP Transferase Aktivitéit mat nsp9 als Substrat, während den nsp12_K4465A aktive Site Mutant inaktiv ass.Déi duebel Substitutioun an der SDD charakteristescher Sequenz vum RdRp Motiv C beaflosst net d'UMP Transferase Aktivitéit (Figure 6B), wat beweist datt d'RdRp Aktivitéit keen direkten Effekt an der nsp9 UMPylatioun huet.Ähnlech Daten goufe mat CTP, GTP an ATP kritt (SI Unhang, Dorënner S10).Zesummegefaasst weisen dës Donnéeën datt NiRAN-mediéiert nsp9 NMPylatioun eng konservativ Aktivitéit bei Coronavirussen huet, déi verschidde Gattunge vun der Orthocoronavirus Ënnerfamilie representéieren.
SARS-CoV-2 nsp12-mediéiert NMPylatioun vun nsp9.(A) Coomassie gefierft SDS-Polyacrylamidgel weist de rekombinante Protein deen am NMPylatiounstest benotzt gëtt.Als Kontroll gouf e mutant Protein mat aktive Sitesubstitutioun am NiRAN Domain (K4465A) an RdRp Domain (DD5152/3AA) vum SARS-CoV-2 nsp12 benotzt.D'Reschtnummeréierung baséiert op der Positioun an pp1ab.(B) Autoradiograph vun UMPylatiounserkennung mat nsp9-His6 an [α-32P]UTP als Substrat vun nsp12-His6 (Wildtyp [wt] a mutant).D'molekulare Mass (a kilodaltons) vum markéierte Protein gëtt op der lénker Säit gewisen.
NiRAN Domänen ginn allgemeng an Nidovirales (16) konservéiert, wat beweist datt se enzymatesch Reaktiounen katalyséieren, déi essentiell fir Nidovirus Replikatioun sinn.An dëser Etude konnte mir beweisen datt de NiRAN Domain vum Coronavirus NMP (generéiert aus NTP) op nsp9 transferéiert, e mysteriéist RNA bindend Protein dat an der Virusreplikatioun involvéiert ass (26 ?? 29 ), fir et als en natierlecht Zil ze bestëmmen an Partner vum Coronavirus RTC.
D'NiRAN Domain deelt dräi Haaptrei Motiver (AN, BN, an CN), déi eng ganz kleng Zuel vu Reschter enthalen déi an all Famillen an der monophyletic awer héich differenzéiert Nidovirales Uerdnung konservéiert sinn (8, 16).Rezent Studien hu gewisen datt se strukturell mat enger haaptsächlech oncharakteriséierter Famill vu Proteinkinase-ähnleche Proteinen verbonne sinn, déi ursprénglech d'SelO Famill genannt goufen (17, 19, 22, 30, 31).SelO-Zesummenhang Proteinen hunn Kinase Falten, awer fehlen e puer konservéiert aktive Sitereschter a klassesche Kinasen (22, 32).Baséierend op der ëmgedréint Orientéierung vun ATP-Moleküle, gebonnen un den aktive Site a stabiliséiert duerch spezifesch Interaktiounen, gouf SelO hypothetiséiert an duerno bestätegt fir AMP (amplaz vu Phosphat) op de Proteinsubstrat (22) ze transferéieren, während en anere bakterielle SelO-ähnlechen Protein YdiU huet kierzlech gewise gouf fir d'kovalent Uschloss vun UMP op Tyr a seng Reschter vu verschiddene Proteinsubstrater ze katalyséieren (33).
Fir d'Prognose vun de putativen aktive Sitereschter vum Coronavirus NiRAN Domain ze bestätegen an auszebauen, hu mir biochemesch a ëmgedréint Genetikmethoden benotzt fir Mutatiounsanalyse op de Coronavirus nsp12 auszeféieren (Figur 3D an E a SI Appendix, Figur S3 an Tabell) S1â S4).D'Daten weisen datt den Ersatz vun HCoV-229E K4135, R4178 an D4280 mat Ala eliminéiert in vitro NMP Transferase Aktivitéit a Virusreplikatioun an der Zellkultur (Figure 3D an E a SI Anhang, Figur S3), ënnerstëtzt hir Präsenz am NTP γ-Phosphat (K4135, R4178) an d'Koordinatioun vun aktive Site Metal Ionen (D4280).D'E4145A Ersatz vum konservéierte Glu am Beräich vum Vugelnestvirus virausgesot fir d'K4135 (17) Positioun ze stabiliséieren gouf gewisen fir viral Replikatioun ze eliminéieren, awer iwwerraschend gouf d'Aktivitéit an der in vitro NMPylatiounsassay behalen (Figure 3D an E an SI Appendix, Figur S3 An Dëscher S1-S4).Eng ähnlech Beobachtung gouf gemaach wann déi entspriechend Ersatz am YdiU Homolog vu Salmonella typhimurium (E130A) agefouert gouf (33).Zesummegefaasst ënnerstëtzen dës Donnéeën d'Reguléierungsfunktioun vun dësem konservéierte Rescht anstatt déi katalytesch Funktioun.
Ersatz vun der konservéierter Phe Rescht (F4281A) am Beräich vum Nestovirus am HCoV-229E NiRAN Domain (8) huet zu enger Ofsenkung vun der NMPylatiounsaktivitéit in vitro an enger wesentlecher Ofsenkung vun der Virusreplikatioun an der Zellkultur gefouert (Figure 3D, E a SI) Anhang, Figur S3).D'Daten si konsequent mat der wichteger reglementarescher Funktioun vun dësem Rescht, sou wéi den homologen DFG Motiv Phe Rescht virdru gewisen.A klassesche Proteinkinasen ass et Deel vun der Mg2+ bindend Loop an hëlleft der Wirbelsäule ze montéieren an ze reguléieren???Noutwendeg fir effektiv katalytesch Aktivitéit (32, 34).Ersatz vun Ala an Arg fir K4116 Reschter (am preAN Motiv), respektiv, eliminéiert viral Replikatioun an, wéi erwaart, huet verschidden Effekter op NMP Transferase Aktivitéit in vitro, ofhängeg vun der Aminosaier Säitekette agefouert (Dorënner 3D An E a SI Appendices , Bild S3).Déi funktionell Daten sinn konsequent mat der struktureller Informatioun, wat beweist datt dëse Rescht eng Interaktioun mat ATP-Phosphat (17) etabléiert huet.Am NiRAN Domain vun anere nestéierte Virusfamilljen ass d'Positioun vum HCoV-229E pp1a / pp1ab K4116 vu Lys, Arg oder His (8) besat, wat beweist datt d'funktionell Restriktioun vun dësem spezifesche Rescht entspaant gouf.D'Substitutioun vun D4188A an D4283A eliminéiert oder reduzéiert d'Enzymaktivitéit staark an eliminéiert Virusreplikatioun (Dorënner 3).Dës zwee Reschter sinn am meeschten (awer net all) nest Viren (8) konservéiert, wat eng wichteg Famill-spezifesch awer eventuell net-katalytesch Funktioun beweist.Ala Auswiesselungen vun e puer aner Lys an Asp Reschter (K4113A, D4180A, D4197A an D4273A), déi net an der Coronaviridae oder aner Nestioviridae Famillen conserved sinn (8) goufen als Kontrollen benotzt.Wéi erwaart, sinn dës Auswiesselungen gréisstendeels tolerabel, mat enger liicht Ofsenkung vun der Enzymaktivitéit a viraler Replikatioun an e puer Fäll (Dorënner 3 a SI Appendix, Figur S3).Am Allgemengen sinn d'Coronavirus Mutagenese Daten ganz konsequent mat de Selbst-GMP an ëmgedréint Genetikdaten vun EAV NiRAN-RdRp (16), an deem EAV nsp9 (Coronavirus nsp12 ortholog) Rescht K94 (entspriechend HCoV-229E K4135) wichteg Funktiounen), R124 (entspriechend R4178), D132 (entspriechend D4188), D165 (entspriechend D4280), F166 (entspriechend F4281).Zousätzlech sinn d'HCoV-229E Mutagenesedaten konsequent mat an ausgebaut aus de virdru gemellt SARS-CoV ëmgedréint Genetikdaten (16), grad sou ähnlech wéi déi observéiert fir dat entspriechend CN Motiv Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. phenotype beschriwwen -F219A an HCoV-229E_F4281A (Dorënner 3 D an E an SI Unhang, Dorënner S3 an Table S1-S4).
Am Verglach mat EAV Orthologen (16), déi eng kloer Präferenz fir UTP a GTP hunn (an der Selbst-NMPylatiounsreaktioun), weist eis Studie datt de Coronavirus NiRAN Domain (representéiert duerch HCoV-229E an SARS-CoV-2) effektiv ka sinn transferéiert All véier NMPs, obwuel et e liichte Preferenz fir UMP (Dorënner 1 an 3).Déi relativ niddereg Spezifizitéit vum spezifesche NTP Co-Substrat ass konsequent mat der kierzlech gemellt SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 Superkomposit Struktur, an där ADP-Mg2+ un den aktive Site vum NiRAN bindet, awer net mam Adenin Deel vun der Bildung vu spezifesche Interaktiounen (17).An eiser Etude, huet d'Zort vun Nukleotid an der NMPylation Reaktioun benotzt keen Ënnerscheed Effekt op d'Aktivitéit vun der mutant Protein (SI Anhang, Figur S3), beweist, datt keng vun dëse Reschter enk mat der Bindung vun enger spezifescher Nukleobase Zesummenhang sinn.Déi strukturell Basis a potenziell biologesch Bedeitung vun de verschiddenen NTP Co-Substrat Virléiften, déi an den NiRAN Domänen vu Coronavirussen an arteriellen Viren observéiert ginn, bleiwen ze studéieren;si kënne wouer sinn oder kënnen duerch d'Aschränkungen vun hire jeeweilege Studien sinn.Am Moment kann et net ausgeschloss ginn datt déi potenziell NMPylator Aktivitéit vum arterielle Virus NiRAN Domain (am Verglach zu der virdru charakteriséierter Selbst-NMPylatiounsaktivitéit) eng aner Co-Substrat Präferenz huet, berécksiichtegt datt d'Ähnlechkeet tëscht der arteriell an dem Coronavirus NiRAN Domain ass op seng Limit.Sequenz-baséiert Compare (16).Am Verglach mat der Pseudokinase SelO, déi Mg2+ als Kofaktor benotzt, ass d'Aktivitéit vum Coronavirus an arterielle Virus NiRAN ofhängeg vun Mn2+ (16) (Dorënner 3C a SI Unhang, Figur S1).D'Mn2+ Ofhängegkeet an offensichtlech Präferenz fir UTP ass eng ongewéinlech Feature vu Protein NMPylatoren, a gouf eréischt viru kuerzem am YdiU Protein vu Salmonella typhimurium bestätegt, wat déi strikt Mn2+ ofhängeg Protein Chaperone UMPylatioun katalyséiert fir Zellen vu Stressinduktioun Zell ATP Pool ze schützen ( 33).
Déi kierzlech beschriwwe strukturell Ähnlechkeet tëscht dem Coronavirus NiRAN Domain a celluläre Proteinkinasen (17, 19) bitt zousätzlech Ënnerstëtzung fir NiRAN seng Fäegkeet fir NMP kovalent mat anere Proteinen ze verbannen, déi mir an dëser Etude gemellt hunn.Mir hunn eis Sich no méiglechen NiRAN Ziler op d'Proteine konzentréiert, kodéiert vun HCoV-229E ORF1a, déi bekannt sinn fir direkt oder indirekt RTC's ORF1b-encodéiert Replikase (12, 35) ze hëllefen.Eis Experimenter bidden schlussendlech Beweiser fir déi effektiv a spezifesch NMPylatioun vun nsp9 (Dorënner 2).Wann den Zilprotein an engem molaren Iwwerschoss benotzt gëtt deen 8 bis 10 Mol méi héich ass wéi dee vum Enzym (nsp12), gëtt bestätegt datt nsp9 komplett (mono)NMPiséiert ass (Figur 4).Mir hunn ofgeschloss datt d'Interaktioun tëscht nsp12 an nsp9 kuerzlieweg ass an net e stabile Komplex mat nsp9 bilden (am Feele vun aneren RTC Ënnerunitéiten).Dës Conclusioun gëtt ënnerstëtzt vu Proteininteraktiounsstudien iwwer de SARS-CoV Proteom (35).MS Analyse identifizéiert der Primärschoul Amine vun der N-terminal Rescht vun nsp9 als NMPylation Site (SI Unhang, Figur S5).D'Bildung vun der Phosphoramidatbindung an der N-terminaler Aminogrupp ënnerscheet d'NiRAN-mediéiert NMPylatiounsaktivitéit vun der Pseudomonas syringae SelO-mediéierten AMPylatiounsreaktioun, déi d'Bildung vun O-verbonne AMP bei Ser, Thr oder Tyrreschter Peptideaddukt katalyséiert ( 22), a S. typhimurium YdiU formt O-verbonne (mat Tyr) an N-verbonne (mat His) Peptid-UMP-Addukten.Déi limitéiert Informatioun verfügbar iwwer d'SelO Famill vu Proteinen weist datt d'Membere vun dëser grousser Proteinfamill immens an der Bildung vu Peptid-NMP Addukten ënnerscheeden.Dëst ass eng interessant Observatioun déi weider Studie verdéngt.
D'Daten, déi an dëser Etude kritt goufen, hunn eis dozou gefouert datt d'NMPylatioun vun nsp9 e gratis N-Terminus erfuerdert.Am Kontext vun der viraler Replikatioun gëtt dëst vun der proteolytescher Spaltung vun der nsp8|nsp9 Veraarbechtungsplaz am Replicase Polyprotein pp1a vermëttelt duerch Mpro a pp1ab geliwwert.An de meeschte Coronavirussen ass den Ënnerscheed tëscht dësem spezifesche Site (VKLQ|NNEI an HCoV-229E) an all aner Coronavirus Mpro Spaltplazen Asn (anstatt en anere klenge Rescht, wéi Ala, Ser Oder Gly) besetzen P1â???Plaz (36).D'Peptid Spaltdaten, déi an de fréie Studien kritt goufen, weisen datt d'Spaltungseffizienz vum nsp8|nsp9 Site méi niddereg war wéi déi vun anere Site, wat beweist datt 1) dëse spezifesche Site eng reglementaresch Roll an der rechtzäiteg koordinéierter Veraarbechtung vum C-Terminal huet pp1a Regioun, oder 2) a D'Roll vum spezielle konservéierten nsp9 N-Terminus an der Virusreplikatioun (37).Eis Donnéeën (Dorënner 5A) weisen datt d'rekombinant Form vun nsp9, déi déi richteg N-terminal Sequenz droen, effektiv vun nsp12 NMPiséiert gouf.D'N-terminal flankerende Sequenz gouf vum Faktor Xa (nsp9-His6; SI Unhang, Table S1) oder Mpro-mediated Spaltung (nsp7-11-His6; Dorënner 5A a SI Unhang, Table S1) geläscht.Wichteg ass datt den ongeschniddene nsp9-haltege Virgänger nsp7-11-His6 Resistenz géint NMPylatioun vun nsp12 gewisen huet, wat mat eisen Donnéeën konsequent ass, wat beweist datt den nsp9-NMP Addukt duerch den N-terminal primäre Amin geformt gëtt (SI Appendix, Figur S5) .Fir e méi déif Verständnis vun der NiRAN Substrat Spezifizitéit ze kréien, hu mir eis dunn op déi ugrenzend N-terminal Reschter vun nsp9 fokusséiert.An der Verontreiung vun anere Proteine si se strukturell flexibel, verhënnert datt se an der net markéierter Form vun nsp9 (26 28, 38) erkannt ginn, wat hir limitéiert natierlech Variatioun uginn. Funktioun vum nsp9 N-terminal Fragment.Ala Substitutioune vu konservéierte Reschter an dëser Regioun (Figuren 5C an D a SI Appendix, Figur S8) verroden datt N3826 wesentlech ass fir nsp9 NMPylatioun in vitro, während N3825A an E3827A Auswiesselungen zu enger Ofsenkung vun der NMPylatioun féieren, während M3829A a P3830A Auswiesselungen net maachen. .Natierlech beaflosst d'nsp9 NMPylatioun.Och wann d'Substitutioun vum N-terminalen Asn (N3825A, N3825S) nëmmen e moderéierten Effekt op nsp9 NMPylatioun a Virusreplikatioun an der Zellkultur (Figure 5C an D) huet, huet d'Läschung vun enger Asn-Reschtsequenz aus dem N-terminalen 3825-NN Dipeptid. Et ass fatal fir Viren, wat beweist datt een Asn Rescht erfuerderlech ass virun engem anere Rescht um N-Terminus, am léifsten Asn, obwuel et schéngt datt d'Auswiesselung vun ähnlechen Reschter deelweis toleréiert ka ginn (Dorënner 5B, C, an D).Mir schléissen datt den 3825-NN Dipeptid, besonnesch de konservéierten an essentielle N3826 Rescht am Coronavirus Gamme (SI Appendix, Figure S6), déi korrekt Bindung an Orientéierung vum nsp9 N-Terminus am aktive Site vum NiRAN garantéiert.
Ersatz vun Ala (E3827A) fir de konservéierte Glu vun all Ënnerfamilien behält d'nsp9 NMPylatioun in vitro awer ass fatal fir Virussen an der Zellkultur (Figure 5C an D), wat d'zousätzlech Funktioun vun dësem Rescht uginn, zum Beispill a Schlësselinteraktiounen (NMPyléiert oder onverännert) ) nsp9 N-terminus an aner Faktoren, déi an der Virusreplikatioun involvéiert sinn.Nsp9 Mutatiounen hunn den proteolytesche Prozess vun nsp9 oder all ugrenzend nsps (39) (SI Appendix, Figur S9) net beaflosst, wat beweist datt déi fatal Phänotypen vu verschiddenen observéierten nsp9 Mutatiounen net vun der Dysregulatioun vum C proteolytesche Prozess-terminal pp1a Beräich verursaacht goufen. .
Déi uewe genannte Donnéeën liwweren Beweiser datt no Mpro-mediéierter Behandlung vun der nsp8|9 Spaltplaz an pp1a / pp1ab den N-Terminus vun nsp9 UMPyléiert ka ginn (oder deelweis mat engem aneren NMP geännert ginn).Zousätzlech huet déi exzellent Konservatioun vum N-Terminus vun nsp9 (inklusiv déi eenzeg an invariant Asn Reschter an der Coronavirus Famill) an déi ëmgedréint Genetikdaten, déi an dëser Studie kritt goufen (Figuren 3E an 5D) eis zum Schluss gefouert datt déi beschriwwen nsp9 NMPylatioun ass biologesch verwandt a wesentlech fir Coronavirus Replikatioun.Déi funktionell Konsequenze vun dëser Ännerung bleiwen ze studéieren, zum Beispill, iwwer déi virdru beschriwwen (net spezifesch) nsp9 (onmodifizéiert Form) RNA bindend Aktivitéit (2628).N-terminal NMPylatioun kann och d'Interaktioun vun nsp9 mat Protein oder RNA Substrate beaflossen oder d'Bildung vu verschiddene véier-Niveau Versammlungen.Dës goufen a strukturelle Studien beobachtet a goufen bestätegt funktionell Zesummenhang mat der Coronavirus Replikatioun ze sinn, obwuel besonnesch an der Verontreiung vu Am Fall vun dëser Ännerung (26- ââ29, 40).
Och wann d'Zilspezifizitéit vum Coronavirus NiRAN Domain nach ëmmer méi detailléiert charakteriséiert muss ginn, weisen eis Daten datt d'Proteinzielspezifizitéit vum Coronavirus NiRAN Domain ganz schmuel ass.Obwuel d'Konservatioun vun Schlëssel aktiv Site Reschter (8, 16) am NiRAN Domain vun all nidovirus Famillen staark ënnerstëtzt d'Aktivitéit vun der conserved NMPylator dës Proteinen, d'Identitéit vun de Substrat bindend Pocket Reschter vun dësem Domain Conservatioun a Conservatioun bleiwen ze charakteriséiert. , a kann tëscht verschiddene Famillen vun Nidovirales Zwecker ënnerscheeden.Ähnlech sinn déi relevant Ziler vun anere nestéierte Viren nach net festgeluecht ginn.Si kënne Fern-Orthologe vun nsp9 oder aner Proteine sinn, well d'Sequenzen ausserhalb vun de fënnef Replikase-Domänen, déi allgemeng an nestet Virussen konservéiert sinn, manner konservéiert sinn (8), dorënner de Genom-Array tëscht Mpro an NiRAN, Ënnert hinnen ass nsp9 an der Coronavirus.
Zousätzlech kënne mir am Moment d'Méiglechkeet net ausschléissen datt d'NiRAN Domain zousätzlech (och cellulär) Ziler huet.An dësem Fall ass et derwäert ze erwähnen datt d'bakteriell Homologen an dësem entstanen Protein NMPylatoren (NMPylatoren) (30, 31) "Masterregulatoren" schéngen ze hunn?NMP moduléiert eng Vielfalt vu celluläre Proteinen fir hir Downstream Aktivitéiten ze reguléieren oder ze eliminéieren, doduerch eng Roll an enger Rei vu biologesche Prozesser ze spillen, wéi zB cellulär Stressreaktioun an Redox Homeostasis (22, 33).
An dëser Etude (Dorënner 2 an 4 an SI Appendix, Figuren S3 an S5), mir konnten beweisen, datt nsp12 den UMP (NMP) Deel op eng eenzeg (konservéiert) Positioun an nsp9 transferéierte, während aner Proteinen net geännert goufen am nsp9. benotzt Ënnert de Konditiounen, gutt-definéiert (anstatt loose) Substrat Spezifizitéit ënnerstëtzt.Konsequent mat dësem, am Verglach mat N-terminal nsp9 NMPylatioun, ass d'nsp12's eegen NMPylatiounsaktivitéit ganz niddereg, seng Detektioun erfuerdert méi laang Autoradiographie Belaaschtungszäit, an eng 10-fach Erhéijung vun der nsp12 Konzentratioun gëtt benotzt.Zousätzlech huet eis MS Analyse keng Beweiser fir NMPylatioun vun nsp12 geliwwert, wat suggeréiert datt NiRAN Domain Selbst-NMPylatioun (am beschten) eng sekundär Aktivitéit ass.Wéi och ëmmer, et sollt bemierkt datt aner Studien virleefeg Beweiser geliwwert hunn datt de SelbstAMPylatiounsstatus vum bakterielle NMPylator hir NMPylatiounsaktivitéit op anere Proteinsubstrater kontrolléiere kann (22, 33).Dofir ass méi Fuerschung gebraucht fir déi méiglech funktionell Effekter vun Selbst-NMPylatiounsaktivitéite fir EAV nsp9 (16) a Coronavirus nsp12 (dës Studie) z'ënnersichen, dorënner de proposéierte chaperoneähnlechen Effekt op d'Klappung vum C-terminal RdRp Domain ( 16) an).
Virdrun sinn e puer Hypothesen betreffend déi méiglech Downstream Funktiounen vum nidoviral NiRAN Domain berécksiichtegt, dorënner RNA Ligase, RNA -capped guanylate transferase a Protein priming Aktivitéit (16), awer keng vun hinnen si kompatibel mat de verfügbaren Downstream Funktiounen.D'Informatioun kritt an de folgende Positiounen ass genee déiselwecht Zäit ouni zousätzlech Viraussetzungen ze maachen.D'Daten, déi an dëser Etude kritt goufen, sinn am meeschte konsequent mat (awer kënnen net beweisen) datt d'NiRAN Domain an der Initiatioun vun der Protein-induzéierter RNA Synthese involvéiert ass.Et gouf virdru gegleeft datt d'Funktioun vum NiRAN Domain an 5 ??²-RNA Capping oder RNA Ligatiounsreaktiounen ass net vun dësen an Ënnerstëtzung vun aneren Daten beaflosst.Dofir gëtt zum Beispill den aktive Site vum NiRAN ugesinn fir de konservéierten Asp als allgemeng Basis ze involvéieren (D252 an Pseudomonas syringae SelO; D4271 an HCoV-229E pp1ab; D208 an SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendix, Figur 2) ).S2) (17, 22, 33), während d'Katalyse an der ATP-ofhängeger RNA Ligase a RNA Capping Enzym duerch de kovalenten Enzym-(lysyl-N) -NMP Zwëschenprodukt duerchgefouert gëtt, wat en net geännert Lys Rescht ( 41).Zousätzlech ass déi bemierkenswäert Sequenz-baséiert Spezifizitéit vum Coronavirus NiRAN fir konservéiert Proteinziler an déi entspaant Spezifizitéit fir NTP Co-Substrate (virléift UTP) géint NiRAN-mediéiert Kappenzym oder RNA Ligase-ähnlech Funktiounen.
Natierlech ass vill extra Aarbecht gebraucht fir z'iwwerpréiwen an, wann bewisen, iwwer déi méiglech Roll vum nsp9-UMP (nsp9-NMP) an der Protein-induzéierter RNA-Synthese auszeschaffen, wat e puer interessant awer (bis elo) Berichter verbënnt, déi virdru gemellt goufen. .Isoléiert Observatioune.Zum Beispill ass et festgestallt ginn datt d'Enn vum negativen Strang RNA vum Coronavirus mat engem Oligo (U) Strang ufänkt (42, 43).Dës Beobachtung ass konsequent mat der Iddi datt d'Synthese vun negativ Strang RNA initiéiert gëtt andeems d'UMPyléiert Form vun nsp9 un de Poly(A) Schwanz (Trigger) gebonnen gëtt, wat duerch seng RNA Bindung gefördert ka ginn. aner RTC Protein.Den UMP-Portioun, deen vum nsp9 geliwwert gëtt, kann dann als "Primer" fir nsp7/8/nsp12-mediéiert Oligouridylatioun benotzt ginn, andeems den 3??²-Poly(A) Schwanz an der genomescher RNA oder eng aner Oligo (A) enthale Sequenz benotzt. déngt als Schabloun, ähnlech wéi de Mechanismus fir de Picornavirus VPg Protein etabléiert (44).Wat wann d'Propositioun "net-normativ" ass????D'Initiatioun vun der (Protein-induzéierter) Negativstrang RNA Synthese bitt e Link op d'Observatiounen, wat beweist datt d'Coronavirus negativ Strang RNA um Enn UMP (amplaz vun UTP) huet (42), wat ugesi gëtt fir ze weisen datt de Nukleinsäure Dicer spalt den Enn phosphoryléiert vun enger onbekannter uridinspezifescher Endonuklease.Wann bestätegt, kann dës nukleinsäure hydrolytesch Aktivitéit hëllefen d'oligomeresch UMPyléiert Form vun nsp9 aus dem 5 ² Enn vum nascent negativen Strang ze befreien.Déi méiglech Roll vum nsp9 am Proteinpriming ass och konsequent mat fréiere ëmgedréint Genetikstudien, déi gewisen hunn datt nsp9 (an nsp8) kritesch a spezifesch mat dem konservéierten cis-handelen RNA Element no beim 3 Enn vum Coronavirus Genom interagéieren.45).Laut dësem Bericht kënnen dës fréier Observatioune elo duerch weider Fuerschung iwwerpréift an ausgebaut ginn.
Zesummegefaasst hunn eis Donnéeën d'spezifesch Aktivitéit vun engem propriétaire nestéierten Virusenzymtag festgeluecht, deen un RdRp um N-Terminus verbonnen ass.Am Coronavirus gëtt dës nei entdeckt NiRAN-mediéiert UMPylator / NMPylator Aktivitéit benotzt fir op Mn2+ an ugrenzend Asn Reschter ze vertrauen an d'Bildung vu (niddereg Energie) Phosphoramidatbindunge mat der N-terminal primär Amin ze verursaachen.Duerch Mpro-mediéiert Spaltung op der nsp8 | 9 Spaltplaz kann d'nsp9 Zil fir NMPylatioun benotzt ginn, wat d'funktionell Kupplung tëscht der Protease an dem NiRAN Domain beweist, wat op RdRp erstreckt.D'Konservatioun vu Schlësselreschter am nsp12 NiRAN aktive Site an dem nsp9 Zil, kombinéiert mat Daten aus zwee Coronavirussen abegraff SARS-CoV-2, bitt staark Beweiser datt nsp9 NMPylatioun e Coronavirus ass. Konservativ Feature sinn och e Schlëssel Schrëtt an der Virusreplikatioun.Déi verfügbar Donnéeë féieren eis zum Schluss datt d'spezifesch Roll vun der NMPyléierter Form vun nsp9 an der Protein-induzéierter RNA-Synthese e raisonnabele Szenario fir Coronavirus an aner nested Virussen ass, an NiRAN kann och aner onidentifizéiert Proteinen zielen.Reguléiert de Virus.Host Interaktioun.Wann bestätegt, wäert d'Bedeelegung vu Proteinprimer an der viraler RNA-Synthese d'Sequenzaffinitéit vun den Mpro/3CLpro- a RdRp-Domänen tëscht dem virdru festgestallte Coronavirus a Picornavirus-ähnlechen Supergrupp erhéijen (9), déi elo an de kierzlech etabléierte Pisonivirites vereenegt goufen (9). 46) an der Kategorie.
Eis Donnéeën weisen och datt d'Basis, selektiv a konservativ Enzymaktivitéiten, déi an dëser Etude identifizéiert goufen, als Ziler fir antiviral Medikamenter benotzt kënne ginn.Verbindungen, déi mat der Bindung (a spéider Modifikatioun) vum konservéierten nsp9 N-Terminus am aktiven Site vum NiRAN stéieren, kënnen an effektiv a versatile antiviral Medikamenter entwéckelt ginn, gëeegent fir d'Behandlung vun Déier a Mënsch Coronavirussen aus verschiddenen (Ënner)Gattungen Infektiounen , dorënner SARS-CoV-2 a Mëttleren Osten Otemschwieregkeeten Syndrom Coronavirus.
D'Kodéierungssequenz vum Coronavirus Protein, deen an dëser Etude produzéiert gouf, gouf verstäerkt duerch RT-PCR mat RNA isoléiert aus Huh-7 infizéiert mat HCoV-229E oder Vero E6 infizéiert mat SARS-CoV-2, an agebaut mat Standard Klonprozeduren.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) oder pASK3-Ub-CHis6 (47) Ausdrock Vecteure (SI Unhang, Dëscher S1 an S2).Single Codon Auswiesselungen goufen duerch PCR-baséiert Site-Direkter Mutagenese agefouert (48).Fir d'MBP Fusioun Protein ze produzéieren, goufen E. coli TB1 Zellen mat de passenden pMAL-c2 plasmid Konstruktioun transforméiert (SI Unhang, Table S1).D'Fusiounsprotein gouf duerch Amylose Affinitéitschromatographie gereinegt a mat Faktor Xa gespléckt.Duerno gouf de C-terminal His6-tagged Protein duerch Ni-immobiliséierter Metallaffinitéitschromatographie (Ni-IMAC) gereinegt wéi virdru beschriwwen (49).Fir d'Ubiquitin Fusioun Protein ze produzéieren, benotzt E. coli TB1 Zellen de passenden pASK3-Ub-CHis6 Plasmid Konstruktioun (SI Unhang, Dëscher S1 an S2) an pCGI Plasmid DNA coding ubiquitin-spezifesch C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Transformatioun (47).Den C-terminal His6-tagged Coronavirus Protein gouf gereinegt wéi virdru beschriwwen (50).
De Selbst-NMPylatiounstest vun HCoV-229E nsp12-His6 gouf gemaach wéi am EAV nsp9 beschriwwen (16).Kuerz gesot, nsp12-His6 (0,5 µM) enthält 50 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinethansulfonsäure (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM, Puffer déi spezifizéiert NTP an 0,17 µM passen [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) bei 30 ° C fir 30 Minutten.An all aner (Standard) NMPylatiounsassays vun nsp12-mediéierten nsp9 NMPylatioun ginn d'Reaktiounsbedéngungen wéi follegt ugepasst: nsp12-His6 (0.05 µM) an nsp9-His6 (4 µM) an der Präsenz vun 50 mM HEPES-KOH (pH 8. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM uginn NTP, an 0,17 µM passend [α32-P]NTP.No Inkubatioun fir 10 Minutten bei 30 ° C, gouf d'Reaktiounsprobe mat SDS-PAGE Probebuffer gemëscht: 62,5 mM Tris(Hydroxymethyl)aminomethan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% Glycerol an 0,005% Bromphenol blo.De Protein gouf denaturéiert duerch Heizung bei 90 ° C fir 5 Minutten a getrennt duerch 12% SDS-PAGE.De Gel ass fixéiert a gefierft mat Coomassie Brilliant Blue Léisung (40% Methanol, 10% Essigsäure, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), entfernt, an 20 Stonnen op engem phosphoreszent Bildschierm ausgesat (fir nsp12 vun NMPylatioun z'entdecken) oder (maximal) 2 Stonnen (fir nsp9 NMPylatioun ze bewäerten).En Typhoon 9200 Imager (GE Healthcare) gouf benotzt fir den Écran ze scannen an ImageJ gouf benotzt fir d'Signalintensitéit ze analyséieren.
Fir MS Analyse, 1 µM nsp12-His6 an 10 µM nsp9 (ouni Hexahistidin Tag) goufen an NMPylation Analyse benotzt (SI Unhang, Table S1) an der fräi Konzentratioun vun 500 µM UTP an GTP goufen benotzt.Ofhängeg vun hirer Konzentratioun an der erwaarter Proteinqualitéit, gouf e Waters ACQUITY H-Class HPLC System ausgestatt mat enger MassPrep Kolonn (Waters) benotzt fir 1 bis 10 μL vu gebufferten Proteinléisungen online ze salzen.Den desalted Protein gëtt an d'Elektrospray-Ionquell vum Synapt G2Si Massespektrometer (Waters) duerch de folgende Gradient vu Puffer A (Waasser/0,05% Mieresäure) a Puffer B (Acetonitril/0,045% Mieresäure) eluéiert, an d'Kolonntemperatur ass 60 ° C an engem Flux Taux vun 0,1 ml / min: elution isokratesch mat 5% A fir 2 Minutten, dann engem linear Gradient zu 95% B bannent 8 Minutten, an erhalen 95% B fir weider 4 Minutten.
Positiv Ionen mat engem Masseberäich vu 500 bis 5000 m/z ginn festgestallt.Glu-Fibrinopeptid B gëtt all 45 Sekonnen gemooss fir automatesch Mass Drift Korrektur.Benotzt MassLynx Instrument Software mat MaxEnt1 Extensioun fir eng deconvolve der Moyenne Spektrum no der baseline ofgezu an smoothing.
UMPylated HCoV-229E nsp9 gouf verdaut andeems se sequencing-grade modifizéiert Trypsin (Serva) bäigefüügt an iwwer Nuecht bei 37 ° C inkubéiert.Eng Chromabond C18WP Spin Kolonn (Deelnummer 730522; Macherey-Nagel) gouf benotzt fir d'Peptiden ze entsalten an ze konzentréieren.Schlussendlech gouf de Peptid an 25 μL Waasser opgeléist, wat 5% Acetonitril an 0,1% Mieresäure enthält.
D'Proben goufen duerch MS analyséiert mat engem Orbitrap Velos Pro Massespektrometer (Thermo Scientific).Den ultimativen Nanoâ HPLC System (Dionex), equipéiert mat engem personaliséierten Ennmontéierten 50 cm ??75 μm C18 RP Kolonn gepackt mat 2,4 μm magnetesche Perlen (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Connect mam Massespektrometer online duerch d'Proxeon Nanospray Quell;Sprëtzen 6 μL Trypsin Verdauungsléisung an en 300 μm banneschten Duerchmiesser × ??1 cm C18 PepMap Pre-Konzentratioun Kolonn (Thermo Scientific).Mat Waasser / 0,05% Mieresäure als Léisungsmëttel gouf d'Probe automatesch gefaangen an entsalat mat enger Flowrate vu 6 µL / min.
Déi folgend Gradienten vu Waasser / 0,05% Mieresäure (Léisungsmëttel A) an 80% Acetonitril / 0,045% Mieresäure (Léisungsmëttel B) goufen benotzt fir d'Trennung vun tryptesch Peptiden bei enger Flowrate vun 300 nL / min ze erreechen: 4% B fir 5 Minutten, dann 30 A linear Gradient op 45% B bannent Minutten, an eng linear Erhéijung op 95% Léisungsmëttel B bannent 5 Minutten.Connectéiert d'chromatographesch Kolonn mat engem Edelstahl Nano-Emitter (Proxeon), a sprëtzen d'Eluent direkt op d'heizt Kapillar vum Massespektrometer mat engem Potenzial vun 2.300 V. D'Ëmfro Scan mat enger Resolutioun vu 60.000 am Orbitrap Mass Analyser ass assoziéiert. mat op d'mannst dräi Daten MS / MS scannt, dynamesch ausgeschloss fir 30 Sekonnen, mat linear Ion Fal Kollisioun induzéiert Dissoziatioun oder méi héich Energie Kollisioun Dissoziatioun kombinéiert mat Orbitrap Detektioun, D'Resolutioun ass 7,500.
Post Zäit: Aug-03-2021